李时珍从35岁开始编写《本草纲目》，这是一件考验耐心与定力的事情。
萌生编写《本草纲目》的想法是一种自发的责任，李时珍在历代医药典籍中发现，古代记载本草的书籍存在不少错误，有的前后自相矛盾。为了避免以讹传讹，误导后人，他决定重新编纂一部本草书籍，对草药的药性药理重新梳，他虽然知道这是一项卷帙浩繁的宏大工程，但是并不清楚其间会有多少曲折和困难，这项工程一旦启动，将要面对无数的艰难险阻，需要倾注毕生的心血。《本草纲目》以《证类本草》为蓝本，参考了历代医药书籍种，考古证今，穷究物理，拜车夫、药工、捕蛇者为师。从嘉靖四十四年（）起，李时珍多次外出考察，足迹遍布湖北、湖南、江西、福建、广东、广西、四川、安徽、江苏、浙江等众多名山大川，留下了上千万字札记，厘清了许多疑难问题。如远志这味药，南北朝著名医学家陶弘景说它是小草，像麻黄，但颜色青，开白花。宋代马志却认为它像大青，并责备陶弘景根本不认识远志。此外还有狗脊、贯众的说法也不一致，蕲蛇、鲮鲤（穿山甲）的识别更有争议。
在父亲的启示下，李时珍认识到：“读万卷书”固然重要，但“行万里路”更不可少。于是他开始搜罗百氏，寻访四方，进行了扎实细致的田野调查。为弄清药性，他不厌其烦地探寻打听，亲自见证真相才予采信。比如蕲蛇，指蕲州产的白花蛇，炮制烘干后入药有医治风痹、惊搐、癣癞等功效。开始李时珍只从蛇贩子那里观察了解，后来有行家提醒他，那些蛇是从江南兴国山里捕来的，不是真正的蕲蛇。为了找到真正的蕲蛇，他请教了好几位经验丰富的捕蛇人，获知蕲蛇牙尖有剧毒，人被咬伤，要立即截肢，否则毒气攻心，人会很快死亡。由于蕲蛇药用价值高，所以非常珍贵。州官要求百姓冒生命危险捕捉蕲蛇，以便向皇上进贡。这种现象很早就已存在，柳宗元写的《捕蛇者说》就是不同时代的相同佐证。物以稀为贵，蕲州属地，也并非随处都有蕲蛇，只有城北龙峰山上才有真正的蕲蛇。在捕蛇人的指引下，李时珍终于见到了正宗的蕲蛇，并亲历了捕蛇、制蛇的全过程。后来对于穿山甲他也同样是亲自观察、不轻信传言。从春到秋，呕心沥血、孜孜不倦，在万历六年（），《本草纲目》初稿终于完成。在中医药发展的浩瀚长河中，二十七载的时光并不漫长，只是草木的几番枯荣；而对个体生命来说，已是半生年华、全部心血。此时李时珍已花甲之年，虽然两鬓斑白，可他仍然全神贯注、皓首穷经，在初稿的基础上又花了十年，反复认证，做了三次增删修改，前后耗时二十余年，最终得以完稿。《本草纲目》完成后，李时珍希望早日刊印。为了推出此书，年逾古稀的李时珍，从武昌赶往当时的出版业中心——南京，想通过书商来帮助出版。由于长期操劳、积劳成疾，李时珍在奔波途中病倒。精通医药的李时珍对自己的病情似乎有了预感，于是他在病中嘱咐儿子，将来要把《本草纲目》呈献朝廷，借助官方的力量传布于世。万历二十二年（），李时珍带着未了的心愿，溘然长逝。在李时珍离世不久，为充实国家书库，明神宗朱翊钧下令全国各地向朝廷献书，李时珍次子李建元非常高兴，感觉良机已到，立即将父亲的遗著《本草纲目》献上。
李时珍一生的艰辛努力，就是为了一部著作。这部52卷，万字，记载了种药物、余幅图谱、多条药方的巨著，被世界生物学泰斗达尔文称为“中国古代的百科全书”“东方医药巨典”。